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传染病(MDx)现场检测的分子诊断平台：SARS-CoV-2
Meya Kuo, Neo Yang, Jerry Liu, Varouj Amirkhanian & Eric Tsai BiOptic, Inc. (www.bioptic.com.tw)
背景:RT-PCR核酸检测是中国食品药品监督管理局和美国疾病控制与预防中心批准的新冠肺炎诊断标准之一，需要经过培训的技术人员，且检测结果不准确（如假阴性和部分假阳性率高）。RT-PCR检测灵敏度不高、部分患者病毒载量低、COVID-19患者样本采集困难、RT-PCR检测时样本载量不足、样本处理过程中RNA降解等是导致检测结果不准确的主要原因。假阴性检测可能使患者在做出诊断之前要接受多次检测，这给医疗保健系统带来了负担。延误诊断可能导致感染患者错过最佳治疗时间段。假阴性检测还可能导致仍携带残留SARS-CoV-2病毒的感染者过早解除隔离，这些感染者感染了许多其他人。
方法/解决方案:为了解决RT-PCR存在的现有问题，BiOptic公司(www.bioptic.com.tw)创造了一个新颖的解决方案，一个高灵敏度RNA检测方法,采用紧凑场便携式热循环（Qamp-mini）和微型毛细管凝胶电泳（Qsep1系列TM）系统(图1)帮助再检查一遍CT值大于40的端点PCR产品，由于毛细管凝胶电泳系统具有更高的荧光检测灵敏度，可以识别低拷贝的采集样本 (信号较弱)，从而更快、更准确地诊断COVID-19。
图1. 实时荧光定量PCR检测结果的快速、简便步骤
实验:
将含COVID-19核蛋白基因的质粒依次稀释成每个反应约3个拷贝，实时荧光定量PCR 45个周期。一般情况下，Ct值在40-45之间的样品可能不可靠，需要重新测试以获得更准确的定量（图2 - 3）。
图2. 采用BiOptic毛细管凝胶电泳系统检测COVID-19 N基因的实时荧光定量PCR产物
图3. RT-PCR结果为每个反应3个拷贝的质粒，包括一个阳性对照
对于Real-Time PCR (SYBR Green)系统，利用Qsep1系列毛细管凝胶电泳，BiOptic MDx平台可以帮助复查Ct值大于40的样品，荧光信号较弱的样品(图4)。每次分析仅需3-5分钟。
图4. 采用BiOptic毛细管凝胶电泳系统在3~5分钟内检测每个反应中3份质粒
BiOptic MDx平台：
BiOptic MDx平台采用了内部开发的Direct“RT-PCR”试剂，无需核酸提取，为非技术操作人员提供了快速病原体检测的独特解决方案，且结果可重复。此外，由于我们的平台具有更高的灵敏度和更好的检测能力，它解决了与实时PCR系统相关的假阳性问题。此外，BiOptic的MDx平台可以作为实时PCR后的再确认平台，能提供更有效且可靠疾病诊断结果。
1. 直接进行RT-PCR扩增。不需要提取和纯化RNA。将口腔或鼻腔拭子浸入溶液中释放核酸。这些裂解物中的RNA可以用来建立逆转录酶PCR扩增反应。
2. 逆转录酶PCR扩增在Qampmini PCR系统上运行。不需要昂贵的Real-Time PCR仪器。
3. Qampmini的PCR产物经过完整的循环后，使用全自动的Qsep1系列分析系统进行毛细管凝胶电泳（CGE）分析。最多可以快速检测8个样本。
结果：
在一些案例中，RT-PCR检测后给出了可疑的结果，如假阴性结果。利用BiOptic公司的技术对同一样本进行分析，发现这些样本中存在COVID-19 RNA序列，如下面的CGE结果（图5：A和B）所示。这些结果清楚地表明，该技术比标准Real-Time PCR检测更敏感。
图5. 比实时荧光定量PCR检测更灵敏、快速、简单的检测结果
(A) 新冠肺炎检测试剂盒（A公司）：红线:阳性对照，蓝线:阴性对照，绿线： 1号阴性样本的重复，黄线： 2号阴性样本的重复。红色箭头表示Qsep系列检测到的扩增子信号。
(B) Covid-19检测试剂盒（B公司）：红线:阳性对照，蓝线:阴性对照，绿线：1号阴性样品的重复
以上分析表明了我们的检测平台的灵敏度。我们使用Qsep Series (Qsep1系列)对real-time PCR检测为阴性的样本进行分析。很明显，在相应的目标区域可以看到信号峰值。这一优势可以有效减少实时PCR假阴性的问题，每次分析仅需3-5分钟。
现场便携式解决方案：
COVID-19检测所需的一切都装在便携式工具包中，可以带到现场。并不局限于必须在一个设备齐全的实验室里进行化验。裂解缓冲液、PCR引物和试剂、Qampmini PCR Thermal Cycler和Qsep1系列 CGE分析系统都包含在一个手提箱中，可以装载到汽车或SUV的后备箱中进行现场分析(图6)。
简介：
BiOptic的MDx平台能够提供快速、准确、低成本的结果，适合COVID-19分散检测应用。
BiOptic MDx平台的优势是:
• 不提取DNA/RNA：节省30至60分钟
• 针对特定应用的Qampmini PCR：一键进行8个样本运行
• 使用Qsep1系列 CGE系统进行分析：少于7分钟
• 在一个反应中分析多个基因：多重直接“RT-PCR”
• 高检测灵敏度:实时荧光定量PCR验证平台
• 成本效益
• 现场便携式
引用：
1. Meya Kuo, et all: “Infectious Diseases Detection Platform: COVID-19” Labcompare, May 15, 2020
2. Neo Yang, et all: “Rapid Genetic Identification of Meat” Labcompare, April 25, 2019
3. Neo Yang, et all: “A Portable CGE System for Cell Free DNA Detection” Labcompare, January 29, 2018 4. www.bioptic.com.tw
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